Розділ:
- Клінічні дослідження

Нейрорецепторные механизмы действия афобазола

С.Б. Середенин, М.В. Воронин, Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова РАМН, г. Москва

Афобазол – оригинальный селективный анксиолитик, разработан и внедрен в медицинскую практику Научно-исследовательским институтом фармакологии имени В.В. Закусова в сотрудничестве с ЗАО «Мастер Фарм».

Механизм анксиолитического действия афобазола основан на его способности предотвращать стрессиндуцированное падение связывания в бензодиазепиновом участке ГАМК_А-рецептора. Вместе с тем попытки обнаружить связывание афобазола с ГАМК_А-рецепторным комплексом дали отрицательные результаты. Таким образом, восстановление функций указанного рецептора следует рассматривать в качестве результирующего эффекта предшествующих нейрохимических событий. Не менее важным свойством афобазола оказалось его нейропротекторное действие, в опытах in vivo и in vitro, первичные механизмы которого оставались также невыясненными. Поэтому цель настоящей работы – изучение связывания афобазола и его основного метаболита М-11 с рецепторами, отобранными в качестве кандидатов для исследования на основе теоретического анализа фармакологических эффектов препарата.

Материалы и методы исследования

Субстанции афобазола и метаболита М-11 синтезированы в НИИ фармакологии РАМН (рисунок). Препараты исследовали в диапазоне концентраций 10^-3 М – 10^-9 М.

Способность афобазола и М-11 вытеснять высокоаффинные лиганды нейрорецепторов из мест связывания изучена в соответствии с протоколами компании Cereр.

Взаимодействие афобазола и М-11 с d₁-рецепторами изучали на клеточной линии человека Jurkаt. В качестве меченого лиганда использовали [³Н](+)-пентазоцин в концентрации 8 нМ. Препаратом сравнения служил галоперидол (IС₅₀ = 2,2 х 10^-8 М, Кi = 1,3 х 10^-8 М, nН = 1,2). Неспецифическое связывание определяли в присутствии 10 мкМ галоперидола. Время инкубации с клеточной линией составляло 120 минут при температуре 22 °С.

Взаимодействие веществ с рецепторами МТ₃ (МL₂) изучали на ткани мозга сирийского хомяка с применением [¹²⁵I]2-йодомелатонина в концентрации 0,1 нМ. В качестве вещества сравнения использовали мелатонин (IС₅₀ = 6,2 х 10^-8 М, Кi = 6,1 х 10^-8 М, nН = 1,1). Неспецифическое связывание определяли в присутствии 30 мкМ мелатонина. Инкубация с образцами ткани мозга длилась 30 минут при температуре 4 °С.

Взаимодействие веществ с рекомбинантными МТ₁-рецепторами человека изучали на овариальной клеточной линии китайского хомяка (СНO клетки). В качестве меченого лиганда использовали [¹²⁵I]2-йодомелатонин в концентрации 0,025 нМ. В качестве вещества сравнения использовали мелатонин (IС50 = 2,6 х 10^-10 М, Кi = 1,6 х 10^-10 М, nН = 1,2). Неспецифическое связывание определяли в присутствии 1 мкМ мелатонина. Время инкубации с клеточной линией составляло 60 минут при температуре 22 °С.

Взаимодействие веществ с моноаминоксидазой А (МАО-А) изучали на ткани коры большого мозга крыс. В качестве меченого лиганда использовали [³H]Ro 41-1049 в концентрации 1,0 нМ. Веществом сравнения служил ингибитор МАО-А хлоргилин (IC₅₀ = 2,7 х 10^-9 M, Ki = 1,6 х 10^-9 М, nН = 1,6). Неспецифическое связывание определяли в присутствии 1 мкМ хлоргилина. Инкубация с образцами коры большого мозга крыс длилась 60 минут при температуре 37 °С.

В радиолигандных исследованиях было обнаружено связывание с d₁-рецепторами, поэтому исходя из литературных данных о транслокации d₁-рецепторов при взаимодействии с лигандами из мембран эндоплазматического ретикулума в область наружной мембраны клетки, проведено исследование эффектов афобазола методом конфокальной микроскопии с иммунофлюоресцентным окрашиванием.

Влияние афобазола на активность МАО-А исследовали на митохондриях мозга и печени крыс. Митохондрии мозга и печени крыс выделяли методом дифференциального центрифугирования. Активность МАО-А определяли радиометрическим методом, используя 0,1 мМ [¹⁴С]серотонин креатининсульфат в качестве субстрата.

Результаты исследования

В результате радиолигандного анализа обнаружена группа рецепторов-мишеней афобазола. К их числу относятся: d₁-рецептор, рецепторы мелатонина МТ₁ и МТ₃ (МL₂) и регуляторный участок МАО-А. Основной метаболит афобазола М-11 проявил значимое сродство только к рецепторам МТ₃ и МТ₁.

При вытеснении из мест связывания агониста d₁-рецепторов [3Н](+)-пентазоцина в концентрации 8 нМ величины IС50, Кi и nН для афобазола составили 7,1 х 10^-6 М, 5,9 х 10^-6 М и 0,9 соответственно. Величины IС₅₀ и Ki для М-11 находятся в области высоких миллимолярных концентраций, что не позволяет сделать заключение о специфическом взаимодействии М-11 с данным типом рецептора.

Наибольшее сродство афобазола установлено для рецептора МТ₃ (ML₂): IС₅₀ = 9,9 х 10^-7 М, Ki = 9,7 х 10^-7 М, nН = 0,8. МТ₃-рецептор также оказался единственной обнаруженной мишенью основного метаболита афобазола – М-11: IC₅₀ = 4 х 10^-7 М, Ki = 3,9 х 10^-7 М, nН = 0,7. Полученные данные позволяют отнести афобазол и М-11 к группе высокоафинных лигандов МТ₃-рецептора. Афобазол и М-11 в микромолярном диапазоне концентраций взаимодействуют с мелатониновым рецептором 1-го типа (МТ₁). Однако афобазол обладает более высоким сродством к данному типу рецептора.

При изучении взаимодействия афобазола с регуляторным участком МАО-А специфического взаимодействия не обнаружено.

В результате иммунофлуоресцентного окрашивания клеток гиппокампа мыши линии НТ-22 антителами к ?1 и кальнексину установлено, что введение афобазола в среду культивирования вызывает внутриклеточное перераспределение d₁-рецепторов. В контроле d₁-рецепторы отсутствуют в аксонах и локализованы в теле нейронов, а их расположение соответствует локализации маркера эндоплазматического ретикулума – кальнексина. Через 30 минут после внесения афобазола в среду культивирования окрашивание, специфичное для d₁-рецепторов, наблюдается не только в теле нейронов, но и в аксонах. Через 1 час после внесения афобазола видно, что данные рецепторы в значительной мере локализованы близ плазматической мембраны клеток, в том числе, аксонов, в то время как кальнексин по-прежнему остается ассоциированным с мембраной эндоплазматического ретикулума в челе нейронов.

В качестве первичных «мишеней» для афобазола были определены рецепторы d₁, МТ₁, МТ₃ и МАО-А. В доступной литературе сообщений о фармакологических препаратах либо химических соединениях с подобным спектром рецепторных взаимодействий не обнаружено.

Физиологическая роль выявленных молекулярных образований подробно охарактеризована в ряде обзоров и оригинальных статей. Наиболее важно, что эти данные согласуются с установленными ранее анксиолитическими и нейропротекторными эффектами афобазола.

Рецепторы d₁

Предполагается, что d₁-рецептор локализуется преимущественно на эндоплазматическом ретикулуме и имеет два трансмембранных домена. Удивительным и, вероятно, весьма важным свойством d₁-рецептора является способность к миграции в область поверхностной мембраны клетки в составе липидных микродоменов. Липидное окружение d₁-рецептора представлено сфинголипидами и холестерином, служащими каркасом для локализованных в наружной мембране белков рецепторов, ионных каналов ферментов. Таким образом, логично полагать, что инициированный афобазолом транспорт d₁-рецептора в область наружной мембраны может способствовать восстановлению фосфолипидного состава клеточных мембран, который, как известно, нарушается при патологических процессах в результате усиления перекисных реакций. В свою очередь это должно нивелировать зависимые от перекисного окисления липидов нарушения конформации функционально важных белков и нормализовать их активность, что и было установлено для ГАМКА-рецептора в опытах с афобазолом ex vivo.

Так, в экспериментальных исследованиях лиганды d₁-рецепторов проявили ряд фармакологических свойств, среди которых отмечены анксиолитический и нейропротекторные эффекты, схожие с афобазолом. Поскольку d₁-рецепторы являются высококонсервативными белками, количество и локализация которых практически не изменяются в онтогенезе, вовлечены в разнообразные механизмы, поддерживающие гомеостаз клетки и ее жизнеспособность, отвечают на многие эндогенные соединения, изменения концентрации которых имеют приспособительный характер, можно полагать, что эти белки представляют эволюционно выработанные образования, осуществляющие функции защиты клетки при негативных воздействиях, и служат своеобразным «ремонтным комплектом» клетки. Если данная гипотеза окажется верной, то область применения афобазола в клинической практике может быть значительно расширена.

МТ₃-рецепторы

Среди рецепторов мелатонина МТ₃-тип наименее изучен и имеет ряд свойств, позволяющих выделить его в отдельный класс. МТ₃-рецептор представляет регуляторный участок фермента хинонредуктазы 2 (QR2, NQR2 Е. С. 1.10.99.2) и характеризуется быстрой кинетикой процессов ассоциации и диссоциации с лигандами. Аминокислотный состав МТ₃-рецептора из ткани почки сирийского хомяка на 95% совпадает с QR2 человека. Трансфекция гена QR2 человека в клеточную культуру приводила не только к развитию хинонредуктазной активности, но и к возникновению способности к связыванию MCA-NAT (2-methoxycarbonylamino-N-acetyltryptamine) – наиболее специфического лиганда МТ₃-рецептора, что позволило говорить об идентичности молекул фермента и рецептора.

Хинонредуктаза 2 и родственный фермент хинонредуктаза 1 (QR1) катализируют процессы детоксикации высокореактивных экзогенных хинонов, предохраняя клетки от окислительного стресса. Тем не менее, основная биологическая роль QR2 на сегодняшний день до конца не определена. Экспрессия гена QR2 имеет значительные межвидовые различия, однако наибольшее содержание фермента обнаруживается в печени и почках и в меньших количествах – в головном мозге. Промотор гена QR2 включает копию ARE (antioxidant response element) последовательности, отвечающую за индукцию экспрессии в ответ на ряд ксенобиотиков и антиоксидантов. Наличие данной последовательности характерно для многих генов ферментов детоксикации. Несмотря на схожесть ферменты QR1 и QR2 используют разные косубстраты и субстраты, а также реагируют на различные ингибиторы. В восстановительных реакциях QR1 участвуют NADH и NADPH, тогда как QR2 использует N-ribosyldihydronicotinamide (NRH) и N-methyldihydronicotinamide (NMH). Известно немного субстратов QR2. К их числу относят менадион (витамин К3), допахиноны и коэнзим Q0 (убихинон) – единственный известный на сегодняшний день эндогенный субстрат фермента. J.A. Boutin et al. не исключают возможность взаимодействия QR2 с убихинонами с изопрениловыми боковыми цепями различной длины (Q1-Q10). Учитывая способность убихинонов встраиваться в биологические мембраны, в том числе мембраны митохондрий, где они включаются в дыхательную цепь переноса электронов, QR2 может модулировать гомеостаз и энергетический баланс клетки. В этой связи интересно отметить общие клеточные структуры, участвующие в реализации эффектов афобазола как лиганда рецепторов d₁ и МТ₃. Установлено также, что QR2 играет определенную роль в метаболической активации противоопухолевых препаратов из класса хинонов. Несмотря на невысокое содержание фермента в головном мозге, в последнее время особое внимание уделяется его регуляторным функциям в ЦНС. Например, обсуждается влияние полиморфизма промоторной области гена QR2 в регуляции экспрессии и, как следствие, предрасположенности к болезни Паркинсона, а фермент рассматривается в качестве оксидазы токсичных катехоловых хинонов, продуктов окисления дофамина. Фармакологическое значение связывания афобазола с МТ₃-рецептором должно стать предметом дальнейших исследований.

МТ₁-рецептор на сегодняшний день изучен достаточно хорошо. Известно, что данный тип рецептора мелатонина связан с G-белками. Через МТ₁-рецептор мелатонин участвует в регуляции циркадных ритмов. Установлено также, что мелатонин играет важную роль в формировании поведенческих реакций, а лиганды МТ₁-рецептора обладают антидепрессивным и анксиолитическим свойствами. Не исключено, что анксиолитическое действие афобазола опосредуется и через данный тип рецептора. Мягкий антидепрессивный эффект афобазола может проявляться также посредством ингибирования активности МАО-А – классической «мишени» для антидепрессантов.

Таким образом, рецепторограммы, полученные в результате исследования взаимодействия афобазола с нейрорецепторами, и результаты иммунофлюоресцентного исследования in vitro внутриклеточной локализации d₁-рецептора в ответ на введение препарата полностью соответствуют установленным фармакологическим эффектам афобазола, раскрывают первичные механизмы его действия как анксиолитика и нейропротектора и определяют дальнейшие перспективы изучения и применения в фармакотерапии.

Выводы

Установлено взаимодействие афобазола с рецепторами d₁ (Ki = 5,9 х 10^-6 М), МТ₁ (Ki = 1,6 х 10^-5 М), МТ₃ (Ki = 9,7 х 10^-7 М) и регуляторным участком МАО-А (Ki = 3,6^-6 М).

Афобазол в концентрации 10-8 М при 30 и 60 минутах инкубации с иммортализированными клетками гиппокампа НТ-22 вызывает транслокацию d₁-рецептора из эндоплазматического ретикулума в область наружной мембраны клетки.

Статья печатается в сокращении.

Оригинальный текст документа читайте на сайте www.ekf.folium.ru