Идентификация и анализ пептидов в составе церебролизина: пептиды фактора роста нервов

И.Ю. Торшин ^{1, 3}, О.А. Громова ¹, Е.И. Гусев ², И.С. Юргель ¹, А.А. Никонов ², Е.В. Третьяков ³, С.А. Мошковский³, А.В. Жевнеров²

Высокая распространенность цереброваскулярных заболеваний (прежде всего, ишемического инсульта) делает необходимым обоснование выбора препаратов для реабилитации и профилактики. В последние десятилетия происходит интенсивная переоценка важности отдельных компонентов комплексной фармакотерапии инсульта. Так, ранее считалось, что вазоактивные средства имеют наибольшее значение для восстановления функционирования головного мозга. В настоящее время происходит смещение акцента в сторону нейропротективных (препятствующих преждевременному апоптозу нейронов) и нейротрофических (способствующих росту нейронов) препаратов.

Повсеместному внедрению и успешному применению этих лекарственных средств противостоит ряд факторов, таких как догматическая приверженность к упрощенным моделям понимания нейропатофизиологических процессов и упрощенная интерпретация результатов клинических испытаний [1]. Однако, помимо этих достаточно тривиальных факторов, существуют более объективные, научные факторы, а именно, недостаток информации о молекулярных механизмах воздействия современных нейротрофических и нейропротекторных препаратов. Недостаток информации о механизмах воздействия обусловлен, в свою очередь, неполнотой данных о составе медикаментов.

Церебролизин (EBEWE, Австрия) – один из таких препаратов. Церебролизин производится на основе экстракта головного мозга молодых свиней. Инновационное исследование состава данного препарата с использованием белковой масс-спектрометрии [2] показало, что церебролизин представляет собой концентрат низкомолекулярных нейротрофных соединений с молекулярным весом, не превышающим 6000-7000 Да (рис. 1).

Секвенирование (определение аминокислотной последовательности) пептидов, соответствующих легким пептидным фракциям (менее 500 Да), привело к обнаружению в составе церебролизина пептидов тиролиберина (аминокислотная последовательность glu-his-pro), глутатиона (gly-cys-glu), энкефалиноподобного пептида (tyr-gly-gly-phe), а также ряда дипептидов типа ala-pro, val-glu и т. д. [2, 3]. Основными функциями тиролиберина являются усиление выделения тиротропина передней долей гипофиза и стимуляция выделения кортикотропина. Глутатион является антиоксидантом, и отношение концентраций восстановленного и окисленного глутатиона является одной из мер цитотоксичности. Энкефалиноподобный тетрапептид может действовать как агонист энкефалиновых рецепторов. Также были обнаружены десятки различных дипептидов в составе легкой фракции церебролизина (менее 500 Да). К этим дипептидам относятся ala-pro, val-glu, ile-gln, ala-gln и др. Дипептиды в составе легких фракций церебролизина не имеют специфической биологической функции и возникают в процессе приготовления препарата как результат неспецифического протеолиза. Возможно, что дипептиды в составе церебролизина, как и аминокислоты препарата [4], стабилизируют пространственную структуру более крупных пептидов.

Дипептиды и нейропептиды тиролиберин, глутатион и энкефалиноподобный пептид – основные компоненты легких пептидных фракций (200-500 Да) церебролизина [2]. Легкие пептидные фракции соответствуют упомянутым выше пептидам длиной в 2-4 аминокислоты. Эти пептиды, очевидно, не являются единственными.

В настоящей работе проводится уточнение пептидного состава церебролизина на основе новой серии образцов препарата и рассматриваются более подробно пики в районе средних пептидных фракций (молекулярные массы от 500 до 1500 Да). Исследование средних пептидных фракций наиболее интересно, поскольку количество пептидов в этом диапазоне даже несколько выше, чем в диапазоне более легких фракций (рис. 1). Более того, длина пептидов в диапазоне фракций 500-1500 Да составляет 5-10 аминокислот, что говорит о более высокой специфичности биологических функций этих пептидов, чем в случае пептидов более легкой фракции. Исследование проводится с использованием универсального теоретического метода для решения задач молекулярной фармакологии пептидных препаратов [5, 6].

Пептиды: вопросы терминологии

Для облегчения восприятия материала статьи врачами, следует сделать краткий экскурс в терминологию пептидов. В современной молекулярной биологии существует ряд установившихся терминов для описания различных форм аминокислотных последовательностей (полипептидов). Так, короткие аминокислотные последовательности (ориентировочно в 2-50 аминокислот) называются пептидами. Термин «пептид» (с греч. i, что переводится дословно «небольшие перевариваемые») отражает процесс расщепления белков, например, в желудочно-кишечном тракте. Более длинные аминокислотные последовательности (скажем, от 50 до десятков тысяч аминокислот) называются белками. Пептиды, содержащие менее 10 аминокислот, называются олигопептидами, а более 10 аминоксилот – полипептидами. Принято называть белками полипептиды длиной более чем 50 аминокислот, что достаточно условно [7].

Белки – основа функционирования клетки. После синтеза на рибосоме полные бел-ковые последовательности подвергаются специфическому частичному протеолизу, приводящему к образованию биологически активных форм белков. В результате этого специфического протеолиза образуются, к примеру, все биологически активные нейропептиды (энкефалины, эндорфины, адренокортикотропный гормон, вазопрессин, соматостатин, кальцитонин, нейропептид Y и т. д.).

Биологически неактивные фрагменты белков, образующиеся в процессе специфического протеолиза полных аминокислотных последовательностей, называются пропептидами. Часто, однако, пропептидами также называются и сами полные аминокислотные последовательности. Было бы более правильно называть полные аминокислотные последовательности препептидами.

С биохимической точки зрения, аминокислоты соединены друг с другом посредством пептидных связей (рис. 2). При образовании пептидной связи карбоксильная группа (-СООН) одной аминокислоты реагирует с аминогруппой (-NH2) другой аминокислоты с отщеплением одной молекулы воды.

Последовательность аминокислот пишется и читается слева направо: например, последовательность пептида лей-энкефалин записывается как тирозин – глицин – глицин – фенилаланин – лейцин. Для краткости используются трехбуквенные (tyr-gly-gly-phe-leu) и однобуквенные (YGGFL) обозначения аминокислот. Крайне левая аминокислота называется N-концевой (так как имеет свободную аминогруппу – NH2), а крайне правая – С-концевой (имеет свободную СООН-группу). N-концевые пептиды, которые опосредуют транспорт белка внутри клетки, называются сигнальными пептидами.

При неспецифическом протеолизе белков образуются различные пептидные фрагменты, подобные полноценным пептидам. Эти фрагменты называются пептидными мотивами. Например, последовательность лей-энкефалина – YGGFL, а YGGF и GGFL относятся к энкефалиноподобным мотивам. Такого рода пептидные фрагменты часто обладают частичной биологической активностью и могут имитировать воздействие полного пептида/белка. Если мотив обладает биологической активностью, он иногда называется агонистом соответствующего типа рецептора или же пептидом-миметиком, поскольку он имитирует действие полного пептида или белка.

Материалы и методы исследования

В этой статье описываются методы экспериментального исследования пептидного состава церебролизина. Теоретический метод, использованный в настоящем испытании, описан в следующем материале [6].

Процесс экспериментального исследования состоял из четырех частей:

• очистка препарата;

• определение масс-спектра пептидной фракции;

• хроматографическое разделение компонентов;

• установление аминокислотной последовательности пептидов.

Очистка препарата

Очистка препарата состояла в отделении липидной фракции и обессоливании. Для очистки от липидной фракции использовался модифицированный метод Брокерхоффа – Даусона – Хюбшера [8]. Сначала проводили мягкое щелочное дезацилирование фосфолипидов. Методику отрабатывали на смеси 1 мл протеолипосом из 1-20 мг фосфатидилхолина и 0,05-0,2 мг бацитрацина или грамицидина А; 1 мл образца очищенного церебролизина-1 лиофилизовали, доливали гексан, метанол (1 : 1) и разводили в 2 раза 0,25 М NaOH в метаноле. В течение 45 минут инкубировали при встряхивании при комнатной температуре, включая 15 минут при t = 75 °C. Последовательно приливали метанол, гексан и воду (1 : 4 : 4), перемешивали и центрифугировали 1 минуту при 1000 г. Фракцию с гексаном отсасывали, водно-метанольную – нейтрализовали HCl до pH 4-6. К нейтрализованной водно-метанольной фракции добавляли гексан, перемешивали, центрифугировали 1 минуту при 1000 г, осторожно отсасывали фракцию с гексаном, не затрагивая осадок на границе раздела фаз. Повторяли процедуру 4 раза. Водно-метанольную фракцию объединяли, лиофилизировали, осадок ресуспендировали сначала в смеси метанол : вода (1 : 1), супернатант сливали, затем – в смеси хлороформ : метанол (1 : 1), 0,2%-ная трифторуксусная кислота, супернатанты объединяли, высушивали от хлороформа и обессоливали.

Обессоливание

Обессоливание пептидов проводили на мини-колонке при помощи центрифугирования [9]. В мини-колонку 0,75 х 4,5 см (Raining Instrument, США) наливали 2 мл сефадекса G-10 (Pharmacia, Швеция), декантированного в смеси метанол : вода (85 : 15), каплями наливали 160 мкл того же раствора и уравновешивали на центрифуге 1 минуту при 1000 г. Процедуру повторяли до тех пор, пока на выходе не осталось 150 мкл раствора. Далее 160 мкл образца каплями наносили на гель и центрифугировали, как описано выше. Гель после однократного использования заменяли. После процедуры обессоливания потери белка составляли не более 35%.

Получение масс-спектров пептидной фракции

Масс-спектры получали на приборе Reflex IV (Bruker, Германия) MALDI-TOF в рефлекторном режиме, используя азотный лазер с длиной волны 337 нм и частотой импульса 9 Гц в режиме положительных ионов. Время задержки анализатора – 200 нсек, напряжения на электроде ускорителя – 20,0 кВт, накапливающем электроде – 16,5 кВт, фокусирующей линзе – 9,5 кВт, рефлекторе – 23,0 кВт. Параметры масс-спектрометра были оптимизированы для диапазона m/z от 0 до 4000, используя для определения калибровочных констант масс-спектры пептидов [10]. Полученные масс-спектры пептидов дополнительно калибровали по внутренним стандартам по известным массам. Каждый масс-спектр получали усреднением 300 накоплений с разных точек образца при мощности лазерного излучения на уровне порогового значения. Для всех образцов использовали в качестве матрицы 65 мг/мл раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (Fluka, Германия) в 20%-ном ацетонитриле с добавлением 0,1%-ной трифторуксусной кислоты (Merck, Германия). Лиофилизированные пептиды растворяли в 10 мкл 50%-ного ацетонитрила с добавлением 0,1%-ной трифторуксусной кислоты. Далее 0,3 мкл образца наносили на поверхность стальной мишени (Bruker Daltonic, Германия) роботом-дозатором Biomek 2000 0,5-1,5 мл (Beckman Coulter), добавляли 0,3 мкл раствора матрицы и высушивали на воздухе. Для перекристаллизации добавляли 1-2 раза по 0,3 мкл раствора матрицы с промежуточной просушкой на воздухе до получения видимых при 10-кратном увеличении кристаллов. Все использованные растворители, включая воду (Merck, Германия), специально предназначены для масс-спектрометрических исследований.

Хроматографическое разделение компонентов препарата церебролизин

Хроматографическое разделение пептидной фракции проводилось по методу, описанному в работе П.Г. Лохова и соавт. [11] с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии хроматографа AGILENT на колонке Диасорб С16Т (Элсико, Россия). Скорость потока составила 0,8 мл/мин, объем образца – 50-1000 мкл при t = 20 оС. Детекция фракций проводилась посредством УФ-детектора на частоте волны 214 нм.

Установление аминокислотной последовательности пептидов

Определение N-концевой аминокислотной последовательности (секвенирование) проводили на приборе Protein/Peptide Sequencer (модель 477A, Applied Biosystems, США). Идентификацию фенилтиогидантоинов (ФТГ) осуществляли на анализаторе 120A PTH Analyzer (Applied Biosystems, США). В основе методики автоматического определения аминокислотной последовательности пептидов и белков лежит метод химической деградации полипептидной цепи, разработанный П. Эдманом (рис. 3) [12]. Метод Эдмана позволяет последовательно отщеплять N-концевые аминокислотные остатки в виде ФТГ и идентифицировать отщепленные ФТГ-аминокислоты при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии. Вкратце, фенилтиоцианат реагирует с аминогруппой основной цепи с N-конца последовательности. При подщелачивании образуется фенилтиокарбамоил производное, а затем, при подкислении – тиазолиновое производное. Последнее преобразуется в фенилтиогидантоиновое производное N-концевой аминокислоты, которое затем идентифицируется хроматографией.

Результаты исследования и их обсуждение

Как показали результаты хроматографического разделения пептидов в районе 500-1500 Да, концентрация всех пептидных фракций составила около 5мг/мл (что соответствует 0,5%-ному раствору пептидов). Количественное содержание идентифицированных пептидов варьировало в широком диапазоне, так как при производстве препарата стандартизация экстрактов мозга проводится по количеству аминокислот и общему количеству пептидов, но не по концентрациям специфических пептидов. Тем не менее, анализ пептидов в исследованных образцах церебролизина однозначно указал на наличие в них чрезвычайно важных нейропептидов. В таблице 1 приведены пики масс-спектрометрического анализа.

2	402, 430, 528, 540, 607, 625
4	402, 416, 430, 500,540, 562, 607, 647, 678, 789
5	402, 430, 513, 540, 569, 607, 625, 700
6	387, 402, 416, 431, 500, 540, 592, 607,625, 700
7	386, 402, 431, 500, 545, 607
8	408, 423, 432, 441, 545, 562, 609, 693, 765, 823, 944, 964, 1034, 1066, 1152
9	432, 694, 721, 807, 823, 943, 1219, 1257, 1310
Примечание: * – фракция № 8 содержала наибольшее количество пептидов церебролизина.

Как видно из таблицы 1, все исследованные фракции препарата церебролизин содержат какие-либо пептиды. На основании приведенных данных было произведено секвенирование пептидов, встречавшихся в наибольших количествах во всех исследованных фракциях. Определение аминокислотной последовательности проводили с помощью сиквенса по методике Эдмана, идентификацию полученных последовательностей пептидов – посредством поиска в базах данных NCBI (www.ncbi.nlm.gov) и Swiss-Prot (www.expasy.ch). Результаты представлены в таблице 2.

ser-ser-phe-gly-ile (SSFGI)	2, 4, 5, 6, 7, 8	540-545	542	XP_001924499; ABC-транспортный белок (АТФ-связывающая кассета – транспортный белок)
gly-glu-phe-ser-val (GEFSV)	2, 4, 5, 6, 7, 8	607-609	607	Q29074; NGF
asn-ser-tyr-cys-thr-thr-thr (NSYCTTT)	8, 9	823	820	Q29074; NGF
tyr-gly-gly-phe-leu (YGGFL)	6	592	588	P01214; -неоэндорфин-динорфин
gly-gly-phe-Лей-arg (GGFLR)	5, 6	569, 592	582	P01214; -неоэндорфин-динорфин
tyr-gly-gly-phe-met (YGGFM)	2, 4, 5, 6, 7	607	606	prf761141A -эндорфин, prf0506562A -эндорфин, prf764744A -эндорфин, P01192 опиомеланокортин
pro-gln-arg-phe (PQRF)	5	569	579	ACQ82801; нейропептид VF
cys-cys-arg-gln-lys (CCRQK)	4	678	670	O77668; нейропептид орексин (гипокретин)
trp-thr-leu-asn-ser-ala-gly-tyr (WTLNSAGY)	8	944	950	P07480; галанин
Примечание: * – ММ – молекулярная масса пептида, определенная на основании масс-спектрометрии (эксперимент) и рассчитанная на основе секвенированной аминокислотной последовательности (теоретическая).

За исключением фрагмента ser-ser-phe-gly-ile, соответствующего классу ABC-транспортных белков, все идентифицированные пептиды в исследованных образцах церебролизина являются нейропептидами. Пептидный фрагмент ABC-транспортных белков – результат неспецифического протеолиза и не является нейропептидом. Нахождение этого фрагмента в исследуемых фракциях обусловлено, вероятно, высоким содержанием этого белка в мембранах нейронов. Далее проанализирован наиболее важный результат настоящего исследования – установление в составе церебролизина пептидов фактора роста нер-вов (NGF). Другие идентифицированные пептиды рассматриваются в следующем материале [6].

Фактор рост нервов

NGF необходим для развития и восстановления сетей нейронов. В частности, NGF стимулирует деление и дифференциацию симпатических и сенсорных нейронов. Будучи секретирован нейронами, NGF связывается специфическими рецепторами типов TrkA (тирозинкиназа А) и LNGFR (низко-афинный рецептор NGF), которые и стимулируют процессы деления и дифференциации. NGF, не прошедший протеолитической обработки, однако может вызывать апоптоз, взаимодействуя с рецепторами типа LNGFR [13].

Синтезируемая на рибосоме молекула NGF включает 229 аминокислот и состоит из сигнального пептида, пропептида и собственно NGF (табл. 3). Сигнальный пептид и пропептид вырезаются в процессе протеолитической обработки, и фрагмент 110-229 полипептида секретируется нейронами. Собственно нейротрофическое действие оказывает именно этот фрагмент полипептида NGF.

Сигнальный пептид	1-6
Пропептид	7-109
NGF	110-229

В составе церебролизина были найдены два пептида, образовавшихся при протеолизе секретируемой молекулы NGF: GEFSV, соответствующий остаткам 119-123 полного полипептида, и NSYCTTT, соответствующий остаткам 186-192. Эти пептиды образуются при неспецифическом протеолизе NGF в процессе производства препарата и полностью идентичны соответствующим фрагментам в аминокислотной последовательности NGF человека. На рисунке 4 показаны пептиды церебролизина в контексте структуры NGF.

Само по себе расположение этих двух пептидов церебролизина в структуре NGF ничего не позволяет сказать об их функциональном значении. Для выяснения функционального значения данных пептидов была построена интегрированная функциональная карта NGF (табл. 4).

Компактные модули 131-161 165-190 192-214	8 бета-стрэндов Дисульфиды 124-189 167-217 177-219	Модель на основе данных PDB (1WWW), цитокин-подобная структура	Димер
Центр общего заряда 129-131 162-164	Редкие конформации 115-127*	Димер 117-123* 178-181 185-188* 195-197 219-224 Рецептор 111-115 119-123* 128-130 161-163	125 134 139 164 178 202 204
PS00248 Редкие пептиды 183-192*	–	Пептиды GEFSV* и NSYCTTT* идентичны более чем в 50 организмах	134 139 164
Центры заряда «+»:129-131, 162-164 «-»: 129, 163-166	Взаимодействия модулей 195 199-202 208-213	–	Механизм фолдинга 192-214 131-161
Примечания: * – участки молекулы белка, относящиеся к исследуемым пептидам (GEFSV, 119-123 и NSYCTTT, 186-192); 3D – пространственная структура белка; 1D – аминокислотная последовательность.

Биоинформатическая расшифровка интегрированной функциональной карты NGF позволяет

сделать ряд обоснованных заключений о функциях исследуемых пептидов. В частности, данные в таблице 4 указывают на то, что оба пептида имеют большее значение для белок-белковых взаимодейс-твий, чем для стабильности белка. Тот факт, что пептид GEFSV (119-123) обладает редкой конформацией, а пептид NSYCTTT (186-192) характеризуется редко встречающимся аминокислотным составом, указывает на функциональное значение обоих пептидов NGF [14]. Пептид NSYCTTT является частью сигнатуры всех известных NGF: универсальный мотив NGF [GSRE]-C-[KRL]-G-[LIVT]-[DE]-X(3)-[YW]-X-S-X-C (номер PS00248 по базе данных PROSITE), расположенный в структуре NGF с 176 по 189, аминокислотный остаток.

Анализ модели взаимодействия NGF с рецептором, основанной на данных [15], позволяет предположить, что пептид GEFSV (119-123) непосредственно может взаимодействовать с молекулой рецептора, при этом они имеют нейро-трофическую активность. Действительно, известны модельные пептиды, включающие пептид GEFSV и обладающие NGF-подобной активностью [16]. Анализ взаимодействий внутри димера NGF показал, что пептиды GEFSV (119-123) и NSYCTTT (186-192) могут димеризоваться и совместно взаимодействовать с рецептором, увеличивая тем самым константу связывания пептидов с рецептором и, следовательно, нейротрофический эффект и биологическую активность пептида GEFSV. Схема взаимодействия пептида с молекулой рецептора показана на рисунке 5.

Выводы

В настоящем исследовании изучали пептидный состав и биологические функции пептидов в составе фракций церебролизина с молекулярной массой в диапазоне 500-1500 Да. Обнаружение биологически активных пептидов NGF практически во всех фракциях исследованных образцов имеет непреходящее значение для фундаментального осознания нейротрофической активности церебролизина. Во-первых, церебролизин производится на основе экстракта головного мозга молодых свиней. Возраст животного имеет огромное значение – ведь именно в раннем возрасте наиболее высоки уровни различных нейротрофических факторов и, прежде всего, NGF. Во-вторых, существует принципиальное ограничение использования нейротрофического фактора роста как такового в качестве терапевтического средства. При периферическом введении NGF не сможет проникать через гематоэнцефалический барьер, то есть через глиевую подложку церебральных сосудов. Кроме того, пропептид NGF может быть нейротоксичен [17]. В то же время, церебролизин обладает нейроспецифической активностью, сходной с активностью природных нейротрофических факторов. Как показывают результаты настоящего исследования, нейротрофическая активность церебролизина может в значительной мере быть обусловлена наличием пептидных мотивов NGF, миметирующих активность NGF.

Литература

1.Торшин И.Ю., Громова О.А. Нейротрофический эффект церебролизина против воинствующего редукционизма // Казанский неврологический журнал им. Бехтерева. – 2008. – № 8.

2.Громова О.А., Третьяков В.Е., Мошковский С.А., Катаев А.С. Анализ нейропептидной фракции препарата церебролизин // Журнал неврологии и психиатрии им. Корсакова. – 2004. – № 11.

3.Катаев А.С., Анализ низкомолекулярного состава препарата церебролизин и его воздействие на элементный гомеостаз мозга крыс при различных способах введения, автореф. дисс…канд. Мед. Наук. – М.: 2009. – 23 с.

4.Громова О.А., Торшин И.Ю., Гусев Е.И., Никонов А.А. Молекулярные механизмы аминокислот в составе препарата церебролизин // Журнал неврологии и психиатрии им. Корсакова, 2009 (в печати).

5.Torshin I.Yu. Bioinformatics in the post-genomic era: sensing the change from molecular genetics to personalized medicine. Nova Biomedical Books, NY, USA, 2009, In «Bioinformatics in the Post-Genomic Era» series, ISBN: 978-1-60692-217-0.

6.Громова О.А., Торшин И.Ю., Гусев Е.И., Третьяков Е.В., Мошковский А.С. Идентификация и анализ пептидов в составе церебролизина на основе интегрального метода анализа биологических функций белков // Журнал неврологии и психиатрии им. Корсакова, 2009.

7.Северин Е.С. (ред). Биохимия // Геотар-мед, 2007. – 774 с.

8.Кейтс М. Техника липидологии // М.: Мир. – 1975. – 322 с.

Полный список литературы, включающий 17 пунктов, находится в редакции.

¹ Ивановская государственная медицинская академия Росздрава.
² Российский государственный медицинский университет Росздрава.
³ Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.