Вплив холіну та холіну альфосцерату на запалення в головному мозку

Холін та його попередники відіграють важливу роль у метаболізмі нервової системи. До вашої уваги представлено огляд статті S. K. Tayebati et al. «Choline and choline alphoscerate do not modulate inflammatory processes in the rat brain», опублікованої у журналі Nutrients (2017; 9: 1084), у якій викладено результати дослід­жен­ня впливу холіну та холіну альфосцерату на процес запалення в головному мозку шляхом модуляції прозапальних цитокінів і молекул адгезії судинного ендотелію.

Холін є незамінною живильною речовиною, яка важлива для здоров’я та розвитку люди­ни (Zeisel, 2006; Ueland, 2011). Це поперед­ник нейротрасмітера ацетилхоліну та агоніст ацетилхолінових рецепторів (Ulus etal., 1988). Як складова ліпопротеїнів холін задіяний у транспорту­ванні холестерину і жирів через клітинні ­мембра­ни та індукує метаболізм метильних груп, зумовлю­ючи зменшення вмісту гомоцистеїну в плазмі ­крові (Penry and Manore, 2008). Терапія холіном стиму­лює синтез і вивільнення ацетилхоліну, сприя­ючи холінергічній трансмісії (Ilcol etal., 2003).

Ацетилхолін і холін — це базові ­субстрати для процесів пам’яті та когнітивних функцій (Eussen etal., 2007; Sanchez etal., 1984; Deuster etal., 2002; Buchman etal., 2001). Погіршання ­короткотривалої пам’яті в результаті старіння пов’язане зі ­зниженням кількості холінергічних нейронів у головному ­мозку, зменшенням синтезу та вивільненням ацетил­холіну, а також порушенням функції його рецепто­рів (Muller etal., 1991).

Окремі ланки цього процесу також залучені до ­пато­фізіологічного механізму розвитку ­хвороби Альц­геймера (ХА), за якої холінергічні нейрони голов­ного мозку ­стають вразливішими та більш схильні до дегенерації внаслідок пошкод­жен­ня мембранних структур клітини. Про зниження доступності холіну й поси­лення розпаду фосфатидилхоліну дослідники повідомляли як про значущі умови щодо патофізіо­логії розвитку ХА (Wurtman, 1992; Nitsch etal., 1992). Для збереження структурної ­цілісності клітин­них мембран важливі холін і холінергічні попередники (Tayebati etal., 2011; Tayebati and Amenta, 2013). Цитидин-5'-дифосфохолін (ЦДХ) і L-α-глицерилфосфорилхолін (холіну альфосцерат) є попередниками холіну, ефективність яких при лікуванні наслідків цереброваскулярних катастроф і зниженні когнітив­них функцій у результа­ті старіння та ХА підтверд­жено клінічними дока­зовими даними і запропонова­но застосовувати як альтернативу холіну (Sigala etal., 1992; Amenta etal., 1994; Saver, 2008; Amenta and Tayebati., 2008).

ЦДХ і холіну альфосцерат – це природні водорозчинні речовини, що чинять подібні ефекти за різних умов (Sánchez, 1983). При ­оральному введенні ЦДХ та холіну альфосцерат долають ­ге­ма­тоенцефалічний бар’єр і входять до складу фосфоліпідної фракції нейро­плазматичної мембрани та мікросом (Abbiati etal., 1993; Secades, 2011; Tayebati etal., 2013). Уведення ЦДХ індукує синтез структурних ліпідів у нейро­нальних мембранах, сприяє підвищенню інтенсивності церебрального метаболізму та ­посиленню таких нейротрансмітерних систем, як холінергічна та допамінергічна (Tayebati etal., 2013; Tayebati, Tomassoni etal., 2013; Petkov etal., 1990). Діє ЦДХ як стимулятор і нейропротекторний чинник для культивованих дофамінергічних нейронів (Radad etal., 2007). ЦДХ і холіну альфосцерат збільшують вивільнення та біодоступність ацетилхоліну в гіпокампі щурів, сприяють поліпшенню уваги та пам’яті у пацієнтів із судинною деменцією, що вказує на їхню здатність підсилювати холі­нергічні трансмісії (Parnetti etal., 2007; Saver, 2008; Amenta etal., 2008). Як продемонстровано на тваринній моделі, введення ЦДХ захищає від розвитку дефіциту пам’яті при старінні, його застосовують при хронічних церебро­васкулярних розладах (Teather etal., 2003). Іноді ЦДХ призначають також як додатковий засіб до леводопи при ­хворобі Паркінсона (Saver, 2008). У деяких ­дослід­жен­нях ЦДХ вико­ристовували для лікування первинної дегенератив­ної деменції або легких форм первинного погіршення когнітив­них функцій у пацієнтів похилого віку (Fioravanti etal, 2004).

Холіну альфосцерат, ймовірно, найефективніше підсилює вивільнення ацетилхоліну in vivo (Sigala etal., 1992; Traini etal., 2013). На підставі цих доказових даних було досліджено когнітивний домен у пацієнтів із ХА і судинною деменцією (Parnetti etal., 2007; Amenta etal., 2006; Amenta etal., 2012). У преклінічних дослід­жен­нях установлено, що холіну альфосцерат полегшує процес ­навчання та запам’ятовування, поліпшує механізми передачі ­сигналів у головному мозку та зменшує симптоми вікових структурних змін у фронтальній корі та гіпокампі (Sigala etal., 1992; Schettini etal., 1990; Lopez etal., 1991; Amenta etal., 1993). Ця ­сполука сприяє анаболічним процесам, які відповідають за синтез мембранних фосфоліпідів і гліцеро­ліпідів, що чинить позитивний вплив на плинність мембран (Aleppo etal., 1994). В експериментальних моделях старіння мозку продемонстро­вано, що холіну альфосцерат також зменшує ознаки когнітивних розладів і сприяє відновленню нормального запам’ятовування в разі його пору­шення, індукованого скополаміном (Canonico etal., 1990; Drago etal., 1990; Sigala etal., 1992; Amenta etal., 2001).

Висунуто гіпотезу щодо потенційної ­нейропротекторної дії холіну й ЦДХ при різних патологічних і/або непато­логічних станах, в основі яких лежить процес запалення (Tayebati and Amenta; 2013; Zeisel etal., 2009). ­Холінергічні медіатори можуть позитивно позначатися на активації ендо­теліальних клітин запалення та взаємодії ендо­телію з лейко­ци­тами (Saeed etal., 2005; Peter etal., 2010). Позитивний холінергічний протизапальний вплив на ендо­теліальну функцію продемонстровано через активацію проти­запальних нейроімунологічних механізмів, які моду­люють природну імунну відповідь шляхом обмеження прозапального процесу, мінімізуючи в такий спосіб трав­мування тканин (Tracey, 2007; Tracey, 2009). Метою дослід­жен­ня було подальше вивчення ефекту холіну та холіну альфосцерату на модуляцію процесів запалення у мозку щурів за допомогою аналізу впливу цих речовин на цитокіни: інтер­лейкін-1β (ІЛ-1β), інтерлейкін-6 (ІЛ-6) і фактор некрозу пухлин α (ФНП-α) і молекули адгезії судинного ­ендотелію.

Матеріали та методи дослід­жен­ня

Дослід­жен­ня на тваринах проводили з дотриманням визнаних міжнародних принципів повод­жен­ня з ла­бо­раторними тваринами (Директива Ради Європи від 18 ­грудня 1986 року). Самцям щурів лінії Wistar (маса тіла 220 ± 20 г, n = 24) протягом двох тижнів вводили:

• холіну хлорид у дозуванні 87 мг/кг/добу (65 мг/кг/добу в перерахунку на холін, n = 8);
•  холіну альфосцерат в еквівалентному за холіном дозуванні (150 мг/кг/добу, n = 8);
• розчинник (вода для ін’єкцій, n = 8).

Лобну кору правої півкулі, гіпокамп і мозочок ­висікали та аналізували методом вестерн-блотингу. Зразки гомогенізували, двічі центрифугували при 13 тис. об/хв ­протягом 10 хв при 4 °C. Однакову кількість білків (40 мкг) розділяли за методом електрофорезу в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію і переносили на нітро­целюлозну мембрану шляхом електроблотингу (Towbin etal., 1979). Трансблотовані мембрани інку­бували з поліклональними антитілами. Специфічність імунної реакції оцінювали за допомогою антитіл, заздалегідь адсорбованих пептидами, використаними для їх отримання. Інкубували препарати з первинними анти­тілами в оптимальній концентрації протягом 12 годин при 4 °C, запобігаючи неспецифічному зв’язуванню IgG. Деякі зрізи інкубували з неімунною сироваткою, а не з первинними антитілами, щоб оцінити фон ­імунного забарвлення. Перед дегідратацією в етанолі зрізи контрастували гематоксиліном. Середні значення різних дослід­жуваних параметрів ­розраховували для кожної окремої тварини, отримуючи потім значення для груп у вигляді «середнє значення ± стандартне відхилення». Статистичну достовірність відмінностей між серед­німи ­значеннями встановлювали за допомогою дисперсійного аналізу (ANOVA) із застосуванням критерію Ньюмена–Кеулса. Достовірним рівнем значущості для оцінювання відмінностей між досліджуваними групами вважали значення р < 0,05.

Метод імунохімічного аналізу зразків ділянок ­головного мозку тварин застосували для порівняння впливу холіну, холіну альфосцерату (у дозуваннях, еквівалентних за холі­ном) і розчинника на цитокіни й молекули адгезії судинного ендотелію.

Результати дослід­жен­ня

Наприкінці лікування досліджувані групи статистично достовірно не вирізнялися за параметрами маси тіла тварин і маси головного мозку. У різних ділянках (лобна кора, гіпо­камп і мозочок) дані аналізу виявили аналогічну ­картину смуг: 31 кДа для ІЛ-1β, 21 кДа для ІЛ-6 і 26 кДа для ФНП-α, 85 кДа для ММКА-1 і, 110 кДа для МАСЕ-1. Оптичну щільність смуг оцінювали, використовуючи β-актин як референтний білок. Результати вестерн-блот-аналізу смуг для ІЛ-1β та ІЛ-6 продемонстрували, що холіну альфосцерат та холін не змінили експресію цих прозапальних чинників. Статистично недостовірний ефект щодо ФНП-α спостерігали в ділянках головного мозку тварин, які отримували холін і холіну альфосцерат. У різних ділянках головного мозку експресія ММКА-1 була нижчою, ніж МАСЕ-1. Експресія МАСЕ-1 певною мірою (але не досто­вірно) знижувалася в гіпокампі щурів під дією ­холіну; холіну альфосцерат не змінював експресію МАСЕ-1. Ні холіну альфосцерат, ні холін не чинили вплив на експресію ММКА-1 у всіх досліджених тканинах.

Імуногістохімічний аналіз зрізів виявив імунну ­реакцію з ІЛ-1β у всіх досліджених ділянках мозку, локалізовану в позаклітинних просторах навколо тіла нейронів у тварин усіх досліджених груп. Не помічено реакції в межах перикаріону пірамідних нейронів лобної кори і ­гіпокампу. ІЛ-1β-позитивні нейрони виявлені в зернистому шарі кори мозочка. У лобній корі не спостерігали різниці в експресії ІЛ-1β між тваринами, які отримували холін і холіну альфо­сцерат, та тваринами контрольної групи. В ­різних ­структурах мозку тварин усіх досліджених груп відзначали слабку імунну реакцію з ІЛ-6. Переважно імуногістохімічна реакція з ФНП-α була локалізована в гіпокампі; вона була трохи зниженою в суб­полі CA1 гіпокампу тварин, які отримували холіну альфосцерат, але не в лобній корі. Обробка холіном не змінювала експресію ФНП-α у різних дослід­жених ділян­ках мозку. У внутрішньо­мозкових артеріях імунореактивність МАСЕ-1 була вираженішою, порівняно з іншими ­молекулами адгезії ММКА-1; вона локалізувалася на рівні ендотелію і м’язового шару внутрішньомозкових ­артерій незначних розмірів (діаметр < 50 мкм). Ні холіну альфо­сцерат, ні холін не змінювали імунореактивності МАСЕ-1 і ММКА-1.

Холін та його попередники (фосфатидилхолін, ­холі­ну альфосцерат, ЦДХ, сфінгосилфосфорилхолін та лізо­фосфо­тидилхолін) являють собою молекули, які мають потенційну здатність збільшувати вивільнення ацетил­холіну та поліпшувати цілісніть клітинної мембрани (Tayebati etal., 2011; Tayebati and Amenta, 2013; Sigala etal., 1992; Amenta etal., 1994; Tayebati etal., 2015; Tayebati etal., 2009; Bramanti etal., 2008; Tomassoni etal., 2006). Зниження вмісту ацетилхоліну та руйнування клітинних мембран у результаті деяких патологічних процесів може призводити до ушкод­жен­ня клітини та розвитку невро­логічних розладів (Amenta and Tayebati, 2008; Klein, 2000).

З ­іншого боку, АЦ взаємо­діє з клітинами ­вродженого імуні­тету, які експресують α7-суб­одиницю нікотинового ацетилхолінового ­рецептора 7-го типу (α7-нАХР). Актива­ція міжклітинної α7-нАХР-сигнальної трансдукції пригнічує транскрипцію генів прозапальних цитокінів та ак­тивацію ендотеліальних клітин (Tracey, 2007; Tracey, 2009; Chatterjee etal., 2009). Місцеве введення деяких попередників холіну сприяло ­зменшенню набряку тканин та продукуванню ФНП-α у моделі карагінан-індукованого болю при запаленні, опосеред­кованого α7-нАХР (Gurun etal., 2009). Захисний ефект ЦДХ щодо мікросудинної проникності при експериментальній ендотоксемії описано в кількох дослід­жен­нях, проте впливу на адгезію лейкоцитів не зазначено (Schmidt etal., 2015). Вміст тканинних прозапальних цито­кінів (IL-1β, IL-6 і TNF-α) ­знижувався під дією ЦДХ (Cetinkaya etal., 2013). Дефіцит ­холіну посилював індуковану ендотоксином гепатотоксичність (Eastin etal., 1997). Внутрішньовенне введення холіну міні­мізувало ­симптоми ендотоксин-­індукованого ураження органів і зростання вмісту циркулюючого ФНП-α у собак, поліпшувало виживаність мишей з ендотоксичним і септичним шоком (Ilcol, 2005; Parrish etal., 2008). Холін у високій концент­рації (400 мкМ у собак і гризу­нів) здатен активувати нАХР в імунних клітинах (моноцити, лімфоцити, макрофаги) і пригнічувати вивільнення прозапальних цитокінів у відповідь на ендотоксин (Ulus etal., 1998; Parrish etal., 2008).

Пригнічення холіном вивільнення запальних цитокінів із моноцитів/лімфоцитів і/або макрофагів підтверджено даними дослід­жен­ня, згідно з якими у концентрації 150 мМ він пригнічував вивільнення ФНП-α із макрофагів (Parrish etal., 2008; Ilcol etal., 2009). Інші попередники холіну та ­холіну альфосцерату модулювали проліферацію астроглії у дослід­жен­нях як in vitro, так і in vivo, що дає підстави ­припустити можливий захисний вплив на головний мозок (Tayebati etal., 2015; Tayebati etal., 2009; Bramanti etal., 2008; Tomassoni etal., 2006). Оцінювали ефект холіну та холіну альфосцерату на маркери запалення в ­головному мозку за фізіологічних умов. Результати свідчать, що при нормально­му ­функціонуванні холін і холіну альфосцерат не позначаються на рівні досліджених прозапальних цитокінів і мо­лекулах ендо­теліальної адгезії, тобто лікування цими сполуками не чинить вплив на шляхи активації запалення на рівні нейро­нів і внутрішньомозкових артерій. На підставі отриманих даних дослідники висунули припущення, що ­холін і холіну альфосцерат збільшують вивільнення ацетил­холіну і модулюють активність холінергічної та ­дофамінергічної систем, проте не впливають на запалення головного ­мозку (Tayebati etal., 2011; Tayebati etal., 2013; Sigala etal., 1992; Tayebati, Tomassoni, etal., 2013).

Модулюючий ефект ацетилхоліну на процеси ­запалення підтверджено. Для ацетилхоліну характерна нейро­протективна дія як периферична відповідь через холінергічний антизапальний шлях у головному мозку (Suzuki etal., 2006). На тваринній моделі продемонстровано, що тривалий дефіцит везикулярних ацетилхолінових транспортерів призводить до загострення системного та церебрального запалення, а також до активізації нейронів і зростання супутніх поведінкових розладів, ­спричинених уведенням ЛПС (Leite etal., 2016). Вчені вважають, що двоспрямований зв’язок (переважно між глутаматергічними нейронами та гліальними клітинами) призводить до вивільнення ацетилхоліну астроцитами (Araque etal., 2002). Далі ацетилхолін зв’язується з α7-нАХР, локалізованим у мікроглії, активуючи в такий спосіб холінергіч­ний протизапальний процес (Shytle etal., 2004). Зазначений механізм може бути дефектним, що призводитиме до хронізації процесу запалення та посилення поведінко­вих розладів внаслідок впливу ЛПС.

У попередніх дослід­жен­нях впливу холіну альфосцерату на нейронне запалення було зазначено, що при пато­логічних станах (наприклад, гіпертензія, набряк), ця сполука ­чинила протизапальну дію, найімовірніше, завдяки підвищенню вмісту ацетилхоліну. На тваринній ­моделі гіпер­тензії лікування холіну альфосцератом сприяло зменшенню реакції астрогліозу та експресії молекул адгезії (Tayebati etal., 2015; Tayebati etal., 2009; Bramanti etal., 2008; Tomassoni etal., 2006). І навпаки, при фізіологічному стані холіну альфосцерат і холін збільшували вивільнення ацетилхоліну, але не чинили вплив на вивільнення цитокінів та експресію молекул адгезії судинного ендотелію. Без специфічних прозапальних подій ­уведення холіну і холіну альфосцерату та подальше збільшення рівня ацетилхоліну не модулювало протизапальні процеси шляхом активації клітин мікроглії (Tayebati etal., 2011; Tayebati and Amenta, 2013; Tabassum etal., 2017).

Висновок

Автори підсумовують, що попередники холіну сприяють стимуляції холінергічної та моноамінергічної нейро­трансмісії, в описаному експерименті не виявлено ак­тивації специфічних молекул, задіяних у модуляції процесів запалення (Tayebati etal., 2011; Tayebati Amenta, 2013). Тому слід продовжувати вивчення можливих ­протизапальних властивостей попередників холіну в доклінічних і клінічних дослід­жен­нях.

Підготувала Галина Смолій