Идентификация и анализ пептидов в составе церебролизина: пептиды фактора роста нервов

И.Ю. Торшин 1, 3, О.А. Громова 1, Е.И. Гусев 2, И.С. Юргель 1, А.А. Никонов 2, Е.В. Третьяков 3, С.А. Мошковский3, А.В. Жевнеров2
Высокая распространенность цереброваскулярных заболеваний (прежде всего, ишемического инсульта) делает необходимым обоснование выбора препаратов для реабилитации и профилактики. В последние десятилетия происходит интенсивная переоценка важности отдельных компонентов комплексной фармакотерапии инсульта. Так, ранее считалось, что вазоактивные средства имеют наибольшее значение для восстановления функционирования головного мозга. В настоящее время происходит смещение акцента в сторону нейропротективных (препятствующих преждевременному апоптозу нейронов) и нейротрофических (способствующих росту нейронов) препаратов.
Повсеместному внедрению и успешному применению этих лекарственных средств противостоит ряд факторов, таких как догматическая приверженность к упрощенным моделям понимания нейропатофизиологических процессов и упрощенная интерпретация результатов клинических испытаний [1]. Однако, помимо этих достаточно тривиальных факторов, существуют более объективные, научные факторы, а именно, недостаток информации о молекулярных механизмах воздействия современных нейротрофических и нейропротекторных препаратов. Недостаток информации о механизмах воздействия обусловлен, в свою очередь, неполнотой данных о составе медикаментов.

Церебролизин (EBEWE, Австрия) – один из таких препаратов. Церебролизин производится на основе экстракта головного мозга молодых свиней. Инновационное исследование состава данного препарата с использованием белковой масс-спектрометрии [2] показало, что церебролизин представляет собой концентрат низкомолекулярных нейротрофных соединений с молекулярным весом, не превышающим 6000-7000 Да (рис. 1).

tors1.jpg

Секвенирование (определение аминокислотной последовательности) пептидов, соответствующих легким пептидным фракциям (менее 500 Да), привело к обнаружению в составе церебролизина пептидов тиролиберина (аминокислотная последовательность glu-his-pro), глутатиона (gly-cys-glu), энкефалиноподобного пептида (tyr-gly-gly-phe), а также ряда дипептидов типа ala-pro, val-glu и т. д. [2, 3]. Основными функциями тиролиберина являются усиление выделения тиротропина передней долей гипофиза и стимуляция выделения кортикотропина. Глутатион является антиоксидантом, и отношение концентраций восстановленного и окисленного глутатиона является одной из мер цитотоксичности. Энкефалиноподобный тетрапептид может действовать как агонист энкефалиновых рецепторов. Также были обнаружены десятки различных дипептидов в составе легкой фракции церебролизина (менее 500 Да). К этим дипептидам относятся ala-pro, val-glu, ile-gln, ala-gln и др. Дипептиды в составе легких фракций церебролизина не имеют специфической биологической функции и возникают в процессе приготовления препарата как результат неспецифического протеолиза. Возможно, что дипептиды в составе церебролизина, как и аминокислоты препарата [4], стабилизируют пространственную структуру более крупных пептидов.
Дипептиды и нейропептиды тиролиберин, глутатион и энкефалиноподобный пептид – основные компоненты легких пептидных фракций (200-500 Да) церебролизина [2]. Легкие пептидные фракции соответствуют упомянутым выше пептидам длиной в 2-4 аминокислоты. Эти пептиды, очевидно, не являются единственными.

В настоящей работе проводится уточнение пептидного состава церебролизина на основе новой серии образцов препарата и рассматриваются более подробно пики в районе средних пептидных фракций (молекулярные массы от 500 до 1500 Да). Исследование средних пептидных фракций наиболее интересно, поскольку количество пептидов в этом диапазоне даже несколько выше, чем в диапазоне более легких фракций (рис. 1). Более того, длина пептидов в диапазоне фракций 500-1500 Да составляет 5-10 аминокислот, что говорит о более высокой специфичности биологических функций этих пептидов, чем в случае пептидов более легкой фракции. Исследование проводится с использованием универсального теоретического метода для решения задач молекулярной фармакологии пептидных препаратов [5, 6].

Пептиды: вопросы терминологии
Для облегчения восприятия материала статьи врачами, следует сделать краткий экскурс в терминологию пептидов. В современной молекулярной биологии существует ряд установившихся терминов для описания различных форм аминокислотных последовательностей (полипептидов). Так, короткие аминокислотные последовательности (ориентировочно в 2-50 аминокислот) называются пептидами. Термин «пептид» (с греч. i, что переводится дословно «небольшие перевариваемые») отражает процесс расщепления белков, например, в желудочно-кишечном тракте. Более длинные аминокислотные последовательности (скажем, от 50 до десятков тысяч аминокислот) называются белками. Пептиды, содержащие менее 10 аминокислот, называются олигопептидами, а более 10 аминоксилот – полипептидами. Принято называть белками полипептиды длиной более чем 50 аминокислот, что достаточно условно [7].
Белки – основа функционирования клетки. После синтеза на рибосоме полные бел-ковые последовательности подвергаются специфическому частичному протеолизу, приводящему к образованию биологически активных форм белков. В результате этого специфического протеолиза образуются, к примеру, все биологически активные нейропептиды (энкефалины, эндорфины, адренокортикотропный гормон, вазопрессин, соматостатин, кальцитонин, нейропептид Y и т. д.).
Биологически неактивные фрагменты белков, образующиеся в процессе специфического протеолиза полных аминокислотных последовательностей, называются пропептидами. Часто, однако, пропептидами также называются и сами полные аминокислотные последовательности. Было бы более правильно называть полные аминокислотные последовательности препептидами.
С биохимической точки зрения, аминокислоты соединены друг с другом посредством пептидных связей (рис. 2). При образовании пептидной связи карбоксильная группа (-СООН) одной аминокислоты реагирует с аминогруппой (-NH2) другой аминокислоты с отщеплением одной молекулы воды.

Последовательность аминокислот пишется и читается слева направо: например, последовательность пептида лей-энкефалин записывается как тирозин – глицин – глицин – фенилаланин – лейцин. Для краткости используются трехбуквенные (tyr-gly-gly-phe-leu) и однобуквенные (YGGFL) обозначения аминокислот. Крайне левая аминокислота называется N-концевой (так как имеет свободную аминогруппу – NH2), а крайне правая – С-концевой (имеет свободную СООН-группу). N-концевые пептиды, которые опосредуют транспорт белка внутри клетки, называются сигнальными пептидами.

tors2.jpg

При неспецифическом протеолизе белков образуются различные пептидные фрагменты, подобные полноценным пептидам. Эти фрагменты называются пептидными мотивами. Например, последовательность лей-энкефалина – YGGFL, а YGGF и GGFL относятся к энкефалиноподобным мотивам. Такого рода пептидные фрагменты часто обладают частичной биологической активностью и могут имитировать воздействие полного пептида/белка. Если мотив обладает биологической активностью, он иногда называется агонистом соответствующего типа рецептора или же пептидом-миметиком, поскольку он имитирует действие полного пептида или белка.

Материалы и методы исследования
В этой статье описываются методы экспериментального исследования пептидного состава церебролизина. Теоретический метод, использованный в настоящем испытании, описан в следующем материале [6].
Процесс экспериментального исследования состоял из четырех частей:
• очистка препарата;
• определение масс-спектра пептидной фракции;
• хроматографическое разделение компонентов;

• установление аминокислотной последовательности пептидов.

Очистка препарата

Очистка препарата состояла в отделении липидной фракции и обессоливании. Для очистки от липидной фракции использовался модифицированный метод Брокерхоффа – Даусона – Хюбшера [8]. Сначала проводили мягкое щелочное дезацилирование фосфолипидов. Методику отрабатывали на смеси 1 мл протеолипосом из 1-20 мг фосфатидилхолина и 0,05-0,2 мг бацитрацина или грамицидина А; 1 мл образца очищенного церебролизина-1 лиофилизовали, доливали гексан, метанол (1 : 1) и разводили в 2 раза 0,25 М NaOH в метаноле. В течение 45 минут инкубировали при встряхивании при комнатной температуре, включая 15 минут при t = 75 °C. Последовательно приливали метанол, гексан и воду (1 : 4 : 4), перемешивали и центрифугировали 1 минуту при 1000 г. Фракцию с гексаном отсасывали, водно-метанольную – нейтрализовали HCl до pH 4-6. К нейтрализованной водно-метанольной фракции добавляли гексан, перемешивали, центрифугировали 1 минуту при 1000 г, осторожно отсасывали фракцию с гексаном, не затрагивая осадок на границе раздела фаз. Повторяли процедуру 4 раза. Водно-метанольную фракцию объединяли, лиофилизировали, осадок ресуспендировали сначала в смеси метанол : вода (1 : 1), супернатант сливали, затем – в смеси хлороформ : метанол (1 : 1), 0,2%-ная трифторуксусная кислота, супернатанты объединяли, высушивали от хлороформа и обессоливали.

Обессоливание

Обессоливание пептидов проводили на мини-колонке при помощи центрифугирования [9]. В мини-колонку 0,75 х 4,5 см (Raining Instrument, США) наливали 2 мл сефадекса G-10 (Pharmacia, Швеция), декантированного в смеси метанол : вода (85 : 15), каплями наливали 160 мкл того же раствора и уравновешивали на центрифуге 1 минуту при 1000 г. Процедуру повторяли до тех пор, пока на выходе не осталось 150 мкл раствора. Далее 160 мкл образца каплями наносили на гель и центрифугировали, как описано выше. Гель после однократного использования заменяли. После процедуры обессоливания потери белка составляли не более 35%.

Получение масс-спектров пептидной фракции

Масс-спектры получали на приборе Reflex IV (Bruker, Германия) MALDI-TOF в рефлекторном режиме, используя азотный лазер с длиной волны 337 нм и частотой импульса 9 Гц в режиме положительных ионов. Время задержки анализатора – 200 нсек, напряжения на электроде ускорителя – 20,0 кВт, накапливающем электроде – 16,5 кВт, фокусирующей линзе – 9,5 кВт, рефлекторе – 23,0 кВт. Параметры масс-спектрометра были оптимизированы для диапазона m/z от 0 до 4000, используя для определения калибровочных констант масс-спектры пептидов [10]. Полученные масс-спектры пептидов дополнительно калибровали по внутренним стандартам по известным массам. Каждый масс-спектр получали усреднением 300 накоплений с разных точек образца при мощности лазерного излучения на уровне порогового значения. Для всех образцов использовали в качестве матрицы 65 мг/мл раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (Fluka, Германия) в 20%-ном ацетонитриле с добавлением 0,1%-ной трифторуксусной кислоты (Merck, Германия). Лиофилизированные пептиды растворяли в 10 мкл 50%-ного ацетонитрила с добавлением 0,1%-ной трифторуксусной кислоты. Далее 0,3 мкл образца наносили на поверхность стальной мишени (Bruker Daltonic, Германия) роботом-дозатором Biomek 2000 0,5-1,5 мл (Beckman Coulter), добавляли 0,3 мкл раствора матрицы и высушивали на воздухе. Для перекристаллизации добавляли 1-2 раза по 0,3 мкл раствора матрицы с промежуточной просушкой на воздухе до получения видимых при 10-кратном увеличении кристаллов. Все использованные растворители, включая воду (Merck, Германия), специально предназначены для масс-спектрометрических исследований.

Хроматографическое разделение компонентов препарата церебролизин
Хроматографическое разделение пептидной фракции проводилось по методу, описанному в работе П.Г. Лохова и соавт. [11] с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии хроматографа AGILENT на колонке Диасорб С16Т (Элсико, Россия). Скорость потока составила 0,8 мл/мин, объем образца – 50-1000 мкл при t = 20 оС. Детекция фракций проводилась посредством УФ-детектора на частоте волны 214 нм. tors3.jpg

Установление аминокислотной последовательности пептидов

Определение N-концевой аминокислотной последовательности (секвенирование) проводили на приборе Protein/Peptide Sequencer (модель 477A, Applied Biosystems, США). Идентификацию фенилтиогидантоинов (ФТГ) осуществляли на анализаторе 120A PTH Analyzer (Applied Biosystems, США). В основе методики автоматического определения аминокислотной последовательности пептидов и белков лежит метод химической деградации полипептидной цепи, разработанный П. Эдманом (рис. 3) [12]. Метод Эдмана позволяет последовательно отщеплять N-концевые аминокислотные остатки в виде ФТГ и идентифицировать отщепленные ФТГ-аминокислоты при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии. Вкратце, фенилтиоцианат реагирует с аминогруппой основной цепи с N-конца последовательности. При подщелачивании образуется фенилтиокарбамоил производное, а затем, при подкислении – тиазолиновое производное. Последнее преобразуется в фенилтиогидантоиновое производное N-концевой аминокислоты, которое затем идентифицируется хроматографией.

Результаты исследования и их обсуждение
Как показали результаты хроматографического разделения пептидов в районе 500-1500 Да, концентрация всех пептидных фракций составила около 5мг/мл (что соответствует 0,5%-ному раствору пептидов). Количественное содержание идентифицированных пептидов варьировало в широком диапазоне, так как при производстве препарата стандартизация экстрактов мозга проводится по количеству аминокислот и общему количеству пептидов, но не по концентрациям специфических пептидов. Тем не менее, анализ пептидов в исследованных образцах церебролизина однозначно указал на наличие в них чрезвычайно важных нейропептидов. В таблице 1 приведены пики масс-спектрометрического анализа.

2 402, 430, 528, 540, 607, 625
4 402, 416, 430, 500,540, 562, 607, 647, 678, 789
5 402, 430, 513, 540, 569, 607, 625, 700
6 387, 402, 416, 431, 500, 540, 592, 607,625, 700
7 386, 402, 431, 500, 545, 607
8 408, 423, 432, 441, 545, 562, 609, 693, 765, 823, 944, 964, 1034, 1066, 1152
9 432, 694, 721, 807, 823, 943, 1219, 1257, 1310
Примечание: * – фракция № 8 содержала наибольшее количество пептидов церебролизина.

Как видно из таблицы 1, все исследованные фракции препарата церебролизин содержат какие-либо пептиды. На основании приведенных данных было произведено секвенирование пептидов, встречавшихся в наибольших количествах во всех исследованных фракциях. Определение аминокислотной последовательности проводили с помощью сиквенса по методике Эдмана, идентификацию полученных последовательностей пептидов – посредством поиска в базах данных NCBI (www.ncbi.nlm.gov) и Swiss-Prot (www.expasy.ch). Результаты представлены в таблице 2.

ser-ser-phe-gly-ile (SSFGI) 2, 4, 5, 6, 7, 8 540-545 542 XP_001924499; ABC-транспортный белок (АТФ-связывающая кассета – транспортный белок)
gly-glu-phe-ser-val (GEFSV) 2, 4, 5, 6, 7, 8 607-609 607 Q29074; NGF
asn-ser-tyr-cys-thr-thr-thr (NSYCTTT) 8, 9 823 820 Q29074; NGF
tyr-gly-gly-phe-leu (YGGFL) 6 592 588 P01214; -неоэндорфин-динорфин
gly-gly-phe-Лей-arg (GGFLR) 5, 6 569, 592 582 P01214; -неоэндорфин-динорфин
tyr-gly-gly-phe-met (YGGFM) 2, 4, 5, 6, 7 607 606 prf761141A -эндорфин, prf0506562A -эндорфин, prf764744A -эндорфин, P01192 опиомеланокортин
pro-gln-arg-phe (PQRF) 5 569 579 ACQ82801; нейропептид VF
cys-cys-arg-gln-lys (CCRQK) 4 678 670 O77668; нейропептид орексин (гипокретин)
trp-thr-leu-asn-ser-ala-gly-tyr (WTLNSAGY) 8 944 950 P07480; галанин
Примечание: * – ММ – молекулярная масса пептида, определенная на основании масс-спектрометрии (эксперимент) и рассчитанная на основе секвенированной аминокислотной последовательности (теоретическая).

За исключением фрагмента ser-ser-phe-gly-ile, соответствующего классу ABC-транспортных белков, все идентифицированные пептиды в исследованных образцах церебролизина являются нейропептидами. Пептидный фрагмент ABC-транспортных белков – результат неспецифического протеолиза и не является нейропептидом. Нахождение этого фрагмента в исследуемых фракциях обусловлено, вероятно, высоким содержанием этого белка в мембранах нейронов. Далее проанализирован наиболее важный результат настоящего исследования – установление в составе церебролизина пептидов фактора роста нер-вов (NGF). Другие идентифицированные пептиды рассматриваются в следующем материале [6].

Фактор рост нервов
NGF необходим для развития и восстановления сетей нейронов. В частности, NGF стимулирует деление и дифференциацию симпатических и сенсорных нейронов. Будучи секретирован нейронами, NGF связывается специфическими рецепторами типов TrkA (тирозинкиназа А) и LNGFR (низко-афинный рецептор NGF), которые и стимулируют процессы деления и дифференциации. NGF, не прошедший протеолитической обработки, однако может вызывать апоптоз, взаимодействуя с рецепторами типа LNGFR [13].

Синтезируемая на рибосоме молекула NGF включает 229 аминокислот и состоит из сигнального пептида, пропептида и собственно NGF (табл. 3). Сигнальный пептид и пропептид вырезаются в процессе протеолитической обработки, и фрагмент 110-229 полипептида секретируется нейронами. Собственно нейротрофическое действие оказывает именно этот фрагмент полипептида NGF.

Сигнальный пептид 1-6 tors6.jpg
Пропептид 7-109 tors7.jpg
NGF 110-229 tors8.jpg

В составе церебролизина были найдены два пептида, образовавшихся при протеолизе секретируемой молекулы NGF: GEFSV, соответствующий остаткам 119-123 полного полипептида, и NSYCTTT, соответствующий остаткам 186-192. Эти пептиды образуются при неспецифическом протеолизе NGF в процессе производства препарата и полностью идентичны соответствующим фрагментам в аминокислотной последовательности NGF человека. На рисунке 4 показаны пептиды церебролизина в контексте структуры NGF.
Само по себе расположение этих двух пептидов церебролизина в структуре NGF ничего не позволяет сказать об их функциональном значении. Для выяснения функционального значения данных пептидов была построена интегрированная функциональная карта NGF (табл. 4).

Компактные модули
131-161
165-190
192-214
8 бета-стрэндов
Дисульфиды
124-189
167-217
177-219
Модель на основе данных PDB (1WWW),
цитокин-подобная структура
Димер
Центр общего заряда
129-131
162-164
Редкие конформации
115-127*
Димер
117-123*
178-181
185-188*
195-197
219-224
Рецептор
111-115
119-123*
128-130
161-163
125
134
139
164
178
202
204
PS00248
Редкие пептиды
183-192*
Пептиды GEFSV* и NSYCTTT*
идентичны более чем в 50 организмах
134
139
164
Центры заряда
«+»:129-131, 162-164
«-»: 129, 163-166
Взаимодействия модулей
195
199-202
208-213
Механизм фолдинга
192-214
131-161
Примечания: * – участки молекулы белка, относящиеся к исследуемым пептидам (GEFSV, 119-123 и NSYCTTT, 186-192); 3D – пространственная структура белка; 1D – аминокислотная последовательность.

Биоинформатическая расшифровка интегрированной функциональной карты NGF позволяет tors4.jpgtors5.jpgсделать ряд обоснованных заключений о функциях исследуемых пептидов. В частности, данные в таблице 4 указывают на то, что оба пептида имеют большее значение для белок-белковых взаимодейс-твий, чем для стабильности белка. Тот факт, что пептид GEFSV (119-123) обладает редкой конформацией, а пептид NSYCTTT (186-192) характеризуется редко встречающимся аминокислотным составом, указывает на функциональное значение обоих пептидов NGF [14]. Пептид NSYCTTT является частью сигнатуры всех известных NGF: универсальный мотив NGF [GSRE]-C-[KRL]-G-[LIVT]-[DE]-X(3)-[YW]-X-S-X-C (номер PS00248 по базе данных PROSITE), расположенный в структуре NGF с 176 по 189, аминокислотный остаток.

Анализ модели взаимодействия NGF с рецептором, основанной на данных [15], позволяет предположить, что пептид GEFSV (119-123) непосредственно может взаимодействовать с молекулой рецептора, при этом они имеют нейро-трофическую активность. Действительно, известны модельные пептиды, включающие пептид GEFSV и обладающие NGF-подобной активностью [16]. Анализ взаимодействий внутри димера NGF показал, что пептиды GEFSV (119-123) и NSYCTTT (186-192) могут димеризоваться и совместно взаимодействовать с рецептором, увеличивая тем самым константу связывания пептидов с рецептором и, следовательно, нейротрофический эффект и биологическую активность пептида GEFSV. Схема взаимодействия пептида с молекулой рецептора показана на рисунке 5.

Выводы

В настоящем исследовании изучали пептидный состав и биологические функции пептидов в составе фракций церебролизина с молекулярной массой в диапазоне 500-1500 Да. Обнаружение биологически активных пептидов NGF практически во всех фракциях исследованных образцов имеет непреходящее значение для фундаментального осознания нейротрофической активности церебролизина. Во-первых, церебролизин производится на основе экстракта головного мозга молодых свиней. Возраст животного имеет огромное значение – ведь именно в раннем возрасте наиболее высоки уровни различных нейротрофических факторов и, прежде всего, NGF. Во-вторых, существует принципиальное ограничение использования нейротрофического фактора роста как такового в качестве терапевтического средства. При периферическом введении NGF не сможет проникать через гематоэнцефалический барьер, то есть через глиевую подложку церебральных сосудов. Кроме того, пропептид NGF может быть нейротоксичен [17]. В то же время, церебролизин обладает нейроспецифической активностью, сходной с активностью природных нейротрофических факторов. Как показывают результаты настоящего исследования, нейротрофическая активность церебролизина может в значительной мере быть обусловлена наличием пептидных мотивов NGF, миметирующих активность NGF.

Литература
1.Торшин И.Ю., Громова О.А. Нейротрофический эффект церебролизина против воинствующего редукционизма // Казанский неврологический журнал им. Бехтерева. – 2008. – № 8.
2.Громова О.А., Третьяков В.Е., Мошковский С.А., Катаев А.С. Анализ нейропептидной фракции препарата церебролизин // Журнал неврологии и психиатрии им. Корсакова. – 2004. – № 11.
3.Катаев А.С., Анализ низкомолекулярного состава препарата церебролизин и его воздействие на элементный гомеостаз мозга крыс при различных способах введения, автореф. дисс…канд. Мед. Наук. – М.: 2009. – 23 с.
4.Громова О.А., Торшин И.Ю., Гусев Е.И., Никонов А.А. Молекулярные механизмы аминокислот в составе препарата церебролизин // Журнал неврологии и психиатрии им. Корсакова, 2009 (в печати).
5.Torshin I.Yu. Bioinformatics in the post-genomic era: sensing the change from molecular genetics to personalized medicine. Nova Biomedical Books, NY, USA, 2009, In «Bioinformatics in the Post-Genomic Era» series, ISBN: 978-1-60692-217-0.
6.Громова О.А., Торшин И.Ю., Гусев Е.И., Третьяков Е.В., Мошковский А.С. Идентификация и анализ пептидов в составе церебролизина на основе интегрального метода анализа биологических функций белков // Журнал неврологии и психиатрии им. Корсакова, 2009.
7.Северин Е.С. (ред). Биохимия // Геотар-мед, 2007. – 774 с.
8.Кейтс М. Техника липидологии // М.: Мир. – 1975. – 322 с.

Полный список литературы, включающий 17 пунктов, находится в редакции.

1 Ивановская государственная медицинская академия Росздрава.
2 Российский государственный медицинский университет Росздрава.
3 Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.
Поделиться с друзьями:

Партнеры

ЛоготипЛоготипЛоготипЛоготипЛоготип